Mengenal PCR (Polymerase Chain Reaction)

Mengenal PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR atau Polymerase Chain Reaction adalah teknik sintesis dan amplifikasi DNA yang dilakukan secara in vitro. PCR dapat membuat copy DNA dalam jumlah yang berlipat ganda hanya dalam hitungan jam.

Adanya teknik PCR menjadikan ilmu pengetahuan dalam bidang genetika, forensik, maupun evolusi molekuler berkembang dengan pesat.

DOWNLOAD PDF – Prinsip Kerja dan Manfaat Polymerase Chain Reaction (PCR)  

Dalam menanggapi berbagai permasalahan di era globalisasi, dunia kesehatan hewan memiliki dampak yang sangat besar terhadap kesehatan masyarakat.

Adanya penyakit yang bersifat ‘zoonosis’ membuat masyarakat semakin khawatir terhadap kesehatan ternaknya maupun hewan peliharaannya.

Penyakit zoonosis adalah penyakit yang dapat menular dari hewan ke manusia, maupun dari manusia ke hewan. Seiring dengan berkembangnya berbagai jenis makanan, semakin berkembang juga jenis penyakit yang disebabkannya.

Oleh karena itu, deteksi penyakit sedini mungkin sangat diperlukan untuk mencegah perkembangan penyakit yang semakin besar.

Teknologi mutakhir harus diterapkan dalam menangani kasus lapangan secara efektif dan efisien.

Berbagai pengujian sampel seperti ELISA, PCR, HA dan HI merupakan pengujian sample yang biasa dilakukan oleh perusahaan maupun laboratorium itu sendiri sebagai daftar uji coba yang akan dipaparkan dalam laporan pengujian.

Baca juga : ” Pengujian Virus dengan HA dan HI “

Dengan adanya berbagai jenis pengujian modern, diharapkan pencegahan maupun penanganan penyakit dapat dilakukan tepat waktu dan tepat sasaran. Sehingga masyarakat dapat hidup dengan aman , sehat, dan sejahtera.

A. Pengertian PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR adalah metode yang digunakan untuk memperbanyak rantai DNA dengan waktu yang relatif singkat. Perbanyakan rantai DNA melibatkan perlakuan secara berulang (siklik) dengan prinsip Polimerase.

Polimerase ditujukan untuk memperpanjang ikatan primer pada rantai ganda dengan melibatkan adanya dNTPs (deoxynucleotide triphosphates) yang terdiri dari ikatan dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat) , dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat).

Rantai ganda pada DNA akan dipisahkan dengan meningkatkan suhu, sehingga terjadi denaturasi termal. Kemudian didingankan sampai suhu tertentu guna memberikan waktu pada primer untuk menempel pada DNA target (annealing primer).

Kemudian dilakukan lagi pemanasan dan terjadi denaturasi termal, begitu seterusnya. Oleh karena itu, dengan adanya siklus yang berulang, PCR dapat melakukan duplikasi DNA dalam waktu yang relatif singkat.

Baca juga : ” Gejala Rabies pada Hewan dan Manusia “

B. Tahapan Uji PCR

Berikut adalah beberapa proses yang terjadi selama PCR :

  1. Pra-denaturasi DNA templat
  2. Denaturasi DNA templat
  3. Penempelan primer pada templat (annealing primer)
  4. Pemanjangan primer (extension primer)
  5. Pemantapan (post- extension)

Untuk lebih jelasnya, perhatikan skema PCR berikut ini :

Tahap pada nomor 2 sampai dengan nomor 4 merupakan proses yang terjadi secara berulang. Dimana tahapan berulang biasanya akan dilakukan sebanyak 30 kali siklus. Karena, pengulangan lebih dari 30 kali akan membuat amplicon (copy DNA) menjadi non target.

Hal tersebut disebabkan karena copy DNA pada PCR tidak terjadi secara keseluruhan (100%). Oleh karena itu, perlu dilakukan optimasi PCR sehingga hasil dari ampicon mencapai target maksimal meskipun tidak mencapai 100%.

C. Optimasi PCR

Optimasi dilakukan dengan mengoptimalkan variasi penggunaan bahan, alat, maupun pengkondisian lingkungan sampel. Berikut adalah beberapa faktor yang sangat berpengaruh terhadap optimasi PCR :

1. Jenis Polimerase DNA

Semakin panjang fragmen DNA, maka dibutuhkan aktivitas polimerase yang lebih tinggi.

2. Suhu

Suhu pada PCR berkaitan erat dengan proses denaturasi, annealing primer, dan ekstensi primer. Jika suhu terlalu tinggi atay terlalu rendah, maka ketiga proses tersebut akan terganggu dan dapat merusak rantai DNA yang sedang mengalami ekstensi atau pemanjangan.

Biasanya denaturasi membutuhkan suhu optimal sekitar 9 – 95°C. Sedangkan Annealing memerlukan suhu sekitar 37-60°C. Sementara pada proses ekstensi primer, suhu yang digunakan selalu 72°C

3. Buffer atau Penyangga

Buffer di dalam dunia medis terdalat dua macam, yaitu low-salt buffer dengan (pH  8,75 dan buffer rendah) juga high-salt buffer dengan (pH 9,2 dan buffer tinggi).

Pada praktik PCR yang memerlukan ekstensi DNA target sekitar 0-5 kilobasa, dibutuhkan low-salt buffer. Sesangkan pada ekstensi DNA target lebih dari 5 kilobasa dibutuhkan high-salt buffer.

4. Waktu

Waktu berkaitan dengan proses untuk denaturasi, annealing primer, dan ekstensi primer. Secara umum, denaturasi membutuhkan waktu sekitar 30-90 detik. Sedangkan pada proses annelaing primer, tergantung pada panjang primernya.

Untuk panjang primer 18-22 kilobasa dibutuhkan waktu 30 detik, sedangkan panjang primer lebih dari 22 kilobasa dibutuhkan waktu 60 detik.

5. Konsentrasi dNTPs (deoxynucleotide triphosphates)

Konsentrasi dNTPs berkaitan dengan panjang DNA target. DNA target dengan panjang 1 kilobasa membutuhkan dNTPs 100 uM. Sedangkan DNA target dengan panjang 1 kilobasa membutuhkan dNTPS sebanyak 200 uM.

6. Konsentrasi MgCl2

Konsentrasi MgCl2 mempengaruhi perolehan PCR. Konsentrasi MgCl yang terlalu rendah menyebabkan perolehan PCR kurang maksimal. Sedangkan konsentrasi MgCl yang terlalu ringgi akan menyebabkan akumulasi produk non target pada perolehan dikarenakan terjadi mispriming. Knsentrasi MgCl yang optimal berkisar antara 1,0-1,5 mM.

7. Konsentrasi Polimerase DNA

Polimerase DNA yang digunakan dalam proses PCR tergantung pada panjang fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Diperlukan sekitar 1,25 – 2 unit per 50 uL campuran reaksi untuk panjang fragmen 2 kilobasa, dan 3 – unit per 50 uL campuran reaksi untuk panjang fragmen lebih dari 2 kilobasa.

Baca juga : ” Perbedaan Kambing dan Domba “

D. Jenis PCR

PCR atau Polymerase Chain Reaction merupakan metode duplikasi DNA yang sangat rentan terhadap kontaminasi.

Oleh karena itu, diperlukan tempat, alat, dan pekerja laboratorium yang steril dari akumulasi benda asing. Biasanya sterilisasi dilakukan dengan penyemprotan Alcohol 70%.

Pada proses penyiapan template, harus dilakukan secara hati-hati. Karena, pada tahapan ini virus mulai direaksikan dengan antigen maupun antibodi.

Meskipun tergolong mahal, amplifikasi DNA yang dihasilkan daei PCR bisa dikatakan akurat. Hal itu dikarenakan DNA Polimerase mampu menghindari kesalahan saat terjadi proses duplikasi.

Berawal dari PCR, sangat banyak temuan di bidang science yang sangat bermanfaat bagi kehidupan. PCR juga telah dikelompkkan berdasarkan tujuan dari dilakukakannya PCR itu sendiri.  Berikut adalah beberapa jenis PCR berdasarkan tujuannya :

1. Inverse PCR

Merupakan metode yang digunakan jika yang diketahu hanya satu sekuen internal saja. Dan dikhususkan dalam identifikasi ‘sekuen antara’ dari beragam gen seperti percobaan yang dilakukan oleh Howard  Ochman, Anne S. Gerber dan Daniel L. Hart pada tahun 1988. Dengan jurnal berjudul “Genetic  Applications of an  Inverse  Polymerase  Chain  Reaction”.

2. Nested PCR

Metode ini bertujuan untuk mengurangi kontaminasi selama proses annealing primer dan mengurangi ekstensi primer yang tidak diperlukan. Sehingga rantai hasil amplikasi lebih pendek dari sebelumnya.

3. Quantitative PCR

Quantitatif PCR digunakan unguk mengukur jumlah DNA, cDNA, dan RNA secara kuantitatif sekaligus menampilkan hasil copy dari sampel yang telah diproses.

4. Reverse Transcriptase (RT-PCR)

Metode ini digunakan dalam amplikasi, isolasi, maupun identifikasi sekuan dari RNA, dengan cara mengubah RNA menjad cDNA.

5. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

Perbedaan organisme dibedakan melalui perbandingan DNA nya dengan RFLP

6. Random Amplified Polymorphic DNA ( RAPD )

Digunakan dalam identifikasi polimorfisme tingkat DNA.

E. Metode PCR

Secara umum, metode PCR terbagi menjadi dua. Yaitu metode konvensional yang biasa disebut dengan konvensional PCR dan metode moder atau komputerisasi yang biasa disebut dengan real time PCR (RRT-PCR).  

1. PCR Konvensional

Pada PCR konvensional, keberadaan DNA dapat dideteksi pada akhir rekasi dengan pengamatan amplifikasi DNA nya dilakukan pada gel agarosa setelah perlakuan elektroforesis. Elektroforesis sendiri terdiri dari injeksi DNA ke dalam gel agarosa.

Kemudian dilakukan konduksi listrik untuk menyatukan gel agarosa tersebut. Hasilnya untai DNA dengan ukuran kecil berpindah dengan cepat sedangkan untai DNA yang berukuran besar di antara gel agarosa menunjukkan hasil yang positif.

Berikut adalah gambaran PCR Konvensional sederhana dan PCR Konvensional dengan menggunakan gel agarosa.

a. Elektroforesis Sederhana

b. Elektroforesis GEL Agarosa

2. Real Time PCR (RRT-PCR)

Pada Real Time PCR (Polymerase Chain Reaction) pembacaan amplicon atau DNA amplifikasi dapat dilakukan bersamaan dengan pengitungan DNA hasil amplifikasi.

Dengan menggunakan perangkat komputer, maka data DNA amplifikasi akan terbaca sekaligus dihitung jumlahnya. Berikut adalah contoh alat RRT-PCR :

F. Manfaat PCR

Manfaat PCR secara umum :

  • Amplifikasi atau copy DNA dengan Reverse Transcriptase (RT-PCR)
  • Kedokteran forensic
  • Identifikasi polimorfisme tingkat DNA
  • Perbandingan DNA organisme dengan RFLP
  • Identifikasi ‘sekuen antara’ dari beragam gen dengan Inverse PCR
  • Diagnosa Kanker

G. Kesimpulan

Pada dasarnya, PCR atau Polymerase Chain Reaction merupakan metode untuk amplifikasi DNA dengan waktu yang singkat. PCR telah dikelompokkan menjadi beberapa jenis berdasarkan tujuan dilakukannya PCR itu sendiri.

Dalam penggunaanya, PCR telah merevolusi dunia keilmuan, khususnya di bidang kedokteran forensic maupun biologi molecular. Oleh karena itu, diharpkan dengan adanya PCR dapat mempermudah diagnosa penyakit maupun pengobatannya.

Daftar Pustaka :

  • Handoyo, Darmo., Ari Rudiretna. 2000. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). Universitas Surabaya: Pusat Studi Bioteknologi.
  • Ochman, Howard., Anne S. Gerber., dkk. 1988. Genetic Applications of an Ineverse Polymerase Chain Reaction. Department of Genetics, Washington  University School of Medicine, St. Louis, Missouri 631 10.
  • Wang, Alice M., Michael V. Doyle., dkk. 1989. Quantitation of mRNA by the Polymerase Chain Reaction. Departments of Molecular Biology and tCell Biology, Cetus Corporation, 1400 Fifty-Third Street, Emeryville, CA 94608.
  • Yusuf, Zuhriana K. 2019. Polymerase Chain Reaction (PCR). Kesehatan Masyarakat FIKK Universitas Negeri Gorontalo 2010. Vol 5:6.